牛冠科研RT-PCR检测试剂盒(荧光定量法)

牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）属于冠状病毒科，冠状病毒属
2a 亚群，是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病学
调查表明，牛冠状病毒在牛场中普遍存在，主要通过消化道和呼吸道传播，感染
的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒，易造成牛群的大范围感染。因此，对带
毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤为重要。本产品就是专门用于牛冠状病
毒的快速荧光 RT-PCR 检测的试剂盒，在毒牛或牛场环境的检测领域有广泛用
途，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒 RNA 模板。
2. 使用 RNase H 已经突变的 SuperMMLV 逆转录酶，减少了 RT 过程中 RNA
的降解。
3. 使用热启动的 Taq DNA 聚合酶，降低了非特异性扩增。
4. 荧光定量检测，所含 SYBR Green I 只与双链 DNA 结合，反应特异性强。适
用于不需要 ROX 做校正染料的荧光 PCR 仪。
5. 产品的有效线性范围广，定量更加准确。
6. 引物经过优化，特异性高，不会误检牛轮状病毒（BRV）、牛病毒性腹泻病毒
（BVDV）和牛流行热病毒（BEFV）等常见牛类病毒。
7. 引物是根据保守的 N 基因设计，产物长度为 100 bp。

运输及保存:

使用方法:

一、样品 RNA 的制备 
用自选方法纯化 BCoV 样品的 RNA，也可以另购本公司的一管式病毒
RNAout 或柱式病毒 RNAout，上述两款产品跟本试剂盒兼容。
二、RT（逆转录）反应合成 cDNA
按照下表配制 RT 反应体系（20 uL 体系）：
成份 用量
RNA 模板（自备） 由于一般不知病毒RNA浓度,用1-10 uL即可
BCoV 专一性引物二 2 uL
RNase-free 水 补水到 13 uL
70℃保温 5 min 变性模板后立即冰浴。
RT Buffer(含 dNTP) 5 uL
37℃保温 5 min。
SuperMMLV 逆转录酶 2 uL
42℃保温 60 min。此步为 RT 反应。
70℃保温 10 min 以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以
直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。
三、设置荧光 PCR 反应（50 uL 体系）
1. 配制 8-10 个浓度范围的标准品：用 DNA 稀释液将 BCoV 标准品稀释成 8-10
个浓度，待用。
2. 在 PCR 管中加入下列成分（N 跟据稀释度由客户自己决定）：
成 份 样品
标准品
（8-10 管）
阴性对照
2×qPCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL
cDNA 样品（上步的 RT 反应液） 1-5 uL 无 无
标准品(8-10 个浓度) 无 N uL 每管 无
BCoV 专一性引物一 2 uL 2 uL 2 uL
BCoV 专一性引物二 2 uL 2 uL 2 uL
补水到 50 uL
3. 上机进行 PCR。荧光定量 PCR 反应参数为（以 ABI7500 荧光定量 PCR 仪
为参考）:
过程 温度 时间
预变性（此步用于活化热启动 Taq 聚合酶） 95℃ 30 s
PCR 反应
（35-40 个循环）
95℃ 5 s
60℃ 30 s
72℃ 10 min
熔解曲线分析
95℃ 5 s
65℃ 1 min
95℃ 15 s
50℃ 30 s
4. 根据 8-10 个标准品的 Ct 值（X 轴）和浓度（X 轴）描出标准曲线，用待测
样品 Ct 值推出其浓度。