鹦鹉热衣原体荧光定量 PCR 检测试剂盒

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci, C.psittaci, Cps) 形状呈圆形或椭圆
形，直径约 0.3μm 左右，在细胞空泡中增值，形成疏松包涵体。鹦鹉热衣原体
是自然性疫源，可在哺乳动物之间传播。鹦鹉热衣原体和沙眼衣原体(C.
trachomatis, Ct)、肺炎衣原体(C.pneumoniae, Cpn)和反刍动物衣原体(C.
pecorum, Cpe)是四种最常见的衣原体。衣原体可以引起哺乳动物的流产、肺炎、
肠炎、脑脊髓炎、多浆膜炎、多关节炎、角膜结膜炎、尿道炎及鸡的输卵管炎等
症。早期、快速、简便检测衣原体对诊治、延缓该病的传播和预防并发症显得尤
为重要。本产品即是基于荧光定量 PCR 法的鹦鹉热衣原体快速检测试剂盒。它
具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板，操作简单，定量准确快速。
2. 根据 Cps 主要外膜蛋白(MOMP)基因的保守序列设计引物，引物经过优化，
特异性高。预期的 PCR 产物长度为 100 bp。
3. 荧光定量 PCR 检测，所含 SYBR Green I 只与双链 DNA 结合，反应特异
性强。
4. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

运输及保存:

使用方法:

一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关
键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体
检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓
度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品
或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产
品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DNA
片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到
10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7
拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充
分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5
拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6
个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个
样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，
并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
三、PCR 检测（20 μL 体系）
1. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次）：
成分 样品 阴性对照
2×qPCR Mix 10 μL 10 μL
Cps DNA 模板 1-5 μL 无
阳性对照 无 无
自备 1×ROX (见注) 2 μL 2 μL
Cps 专一性引物一（正向引物） 1 μL 1 μL
Cps 专一性引物二（反向引物） 1 μL 1 μL
补水到 20 μL
注: 仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光
PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、
MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）
不需要使用 ROX。
2. 建议 PCR 反应参数（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）
过程 温度 时间
活化 95℃ 20 s
PCR 反应
（40 个循环）
95℃ 5 s
60℃ 25 s
熔解曲线分析
95℃ 15 s
60℃ 1 min
95℃ 15 s
60℃ 15 s
3. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合
DNA 时，最大吸收光谱在 471nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500nm，
最大发射光谱在 530nm。
四、数据处理
以 Cps 阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再
以待测样品浓度的 log 为横轴，以 Ct 值为纵轴，通过待测样品的 Ct 值计算
出样品 DNA 的浓度。