布鲁氏菌核酸测定试剂盒（荧光 PCR 法）

布鲁氏菌（brucellosis）为病原微生物，是一种细胞内寄生小球杆状菌，
革兰氏染色阴性，主要感染牛、羊、猪、狗以及骆驼、鹿等动物。布鲁氏菌主要
是通过接触感染的动物或者吃被感染的食物以及实验室接触等方式传播给人类，
能引起人和多种动物的急性和慢急性疾病，被感染的人和动物表现为流产及不孕
不育等症状。
本试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）结合 Taqman 技术，对布鲁氏菌的
特异性 DNA 核酸片段进行荧光检测，可用于临床对布鲁氏菌的辅助诊断，使用
方便，即开即用。血液、骨髓、关节腔液及病畜的组织、奶、奶制品均可作为本
试剂盒的检测标本。标本可立即用于检测，也可保存在-20℃待测。标本运送应
在低温条件下进行。

运输及保存:

使用方法:

一、标本、对照品的核酸裂解处理
1. 骨髓、关节腔液、血清等液态标本：取 50 μL 样本，加入 50 μL 核酸提取
液充分混匀，沸水浴 10 分钟，然后 13,000 rpm 离心 10 分钟，取上清 4
μL 作为 PCR 反应模板。
2. 全血 PBMC 分离：取抗凝血 1 mL，与 Hank’s 液（PBS 或生理盐水）1：
1 混匀后，小心加于 2 mL 的细胞分离液的液面上，2000 rpm 离心 15 分
钟（半径 15 cm 水平转子），收集界面上的细胞（中间呈白色层），置于 1.5
mL eppendorf 管中，2000 rpm 离心 10 分钟，弃上清液。沉淀中加入
50 μL 核酸提取液，振荡 10 秒，99℃干浴或水浴 10 分钟，13,000 rpm
离心 10 分钟，保留上清备用。
3. 奶标本：取奶 3 mL ，13,000 rpm 离心 2 分钟；弃去上清，沉淀中直接
加入 100 μL DNA 提取液充分混匀，沸水浴 10 分钟（误差不超过 1 分钟）。
13,000 rpm 离心 5 分钟，取上清 4 μL 做 PCR 反应。
4. 超纯水作为阴性对照。如进行定量检测，阳性对照品（1×107
copies/mL）需
要进行 10、100、1000 倍梯度稀释。
二、试剂配制
取 n×35 μL 荧光 PCR Mix 与 n×1 μL 内部对照品，以及 n×0.4 μL 酶
（Taq+UNG）（n 为反应管数），振荡混匀数秒，3000 rpm 离心数秒。（备注：
如不使用内部对照品，可用 n×1 μL 的超纯水代替补足。）
三、加样
取上述混合液 36 μL 置于薄壁 PCR 反应管或 PCR 反应板中，然后将已处
理标本、阳性对照品、超纯水各 4 μL 分别加入薄壁 PCR 反应管或 PCR 反应板
中，盖好薄壁 PCR 反应管盖或 PCR 反应板膜，立即进行 PCR 扩增反应。
四、PCR 扩增
反应管置于定量荧光 PCR 仪上，推荐循环参数设置如下：
过程 温度 时间
37℃ 2 分钟
预变性 94℃ 2 分钟
PCR 反应
（40 个循环）
93℃ 15 s
60℃ 60 s
 单点荧光检测在 60℃。反应体系 40μL。
荧光通道检测选择：选用 FAM 和 HEX （或 VIC/JOE）通道。
备注：如使用 ABI 系列 PCR 仪，请务必于 passive reference 和 quencher
处均选择“none”。
五、基线和阈值设定
基线调整取 6-15 个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过超纯
水检测荧光曲线的最高点。
n×35 μL 混合液 + n×1 μL 内对照+ n×0.4 μL 酶
n×36 μL分装 加 4 μL 模板
上机
+
六、校准程序
进行定量检测时需要进行校准程序，阳性对照品处理和加样在使用方法的一
和二中已经说明；实验结束后将阳性对照品浓度输入仪器软件中，仪器自动生成
标准曲线。
七、实际结果的判断
通道 Ct 值 结果判断
FAM UNDET 或 40 样本低于检测限，报告为阴性
FAM ≤38 报告为阳性
FAM 38~40 复检一次，如仍为 38~40，则报告为阴性
进行定量检测时，仪器生成标准曲线后，自动显示待测样品定量值。