Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书

Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒AlamaBlue 细胞活力检测试剂盒提供了一种可靠、灵敏、安全和低成本的快速有效检测细胞活力与毒性的方法。AlamaBlue 通过在细胞生长的培养基中所产生的化学还原反应，将非荧光信号的染料转换成为一红色荧光物质，试卤灵（9-羟基-3-异吩恶嗪酮7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮），从而检测细胞的存活率。维持细胞生产需要还原性环境而抑制生长则表现为氧化型环境。细胞生长率相关的降低可表现为氧化还原指示剂从氧化型（非荧光素、紫色）转为还原型（荧光素、红色）。该荧光信号可以用530~560nm 的激发波激发，在590nm 处可以获发射波，检测570 和600nm 的的吸光度值，校正监测值，可以减去相应的570nm 和600nm 的背景吸光度值。检测所产生的荧光信号是与样品中的活细胞数成正比的。
AlamaBlue 细胞活性检测试剂盒的灵敏度相似于[3H]胸苷法检测细胞增殖法。根据不同类型的细胞，AlamaBlue 可以检测到至少40个细胞，同时保证很好的重现性和灵敏度。作为试卤灵（紫红、红色荧光）可以进一步被还原为水解化的试卤灵（无色、无荧光），当细胞数量增多，所有的刃天青（7-羟基-3-羰基-10-氧化-三氢吩恶嗪）被转换为试卤灵（9-羟基-3-异吩恶嗪酮7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮），试剂盒的信号反而会发生衰减。因此，对于您所用的试剂盒来说，针对不同的细胞类型，应该调整您的细胞数，做相应的优化，才能得到更好的结果。
操作说明
以下操作可用作通用指导建议。考虑不同细胞类型与培养条件的差异性，有必要根据实际情况优化您的操作步骤。
1. 96 孔细胞培养板每孔100μL 培养基饲养细胞，控制细胞数目在40~10000 个/贴壁细胞，2000~500000 个/悬浮细胞。设置空培养基做对照。
2. 加入10μL AlamaBlue 溶液至培养基中，37 度孵育：24 小时（比色法读数）；5-6 小时（荧光读数）。
3. 检测570nm 和600nm 的吸光度，或者用荧光微孔板读数530nm 激发，590nm 发射波读数。
4. 如果采用比色法检测，选择OD570-OD600 检测，如果检测荧光信号，请在校正OD 值后，先设置标准曲线，选择合适您实验的细胞最佳浓度。
Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒注意事项：
1、悬浮细胞用此法时必须经离心后才能吸出上清再加DMSO。
2、Formazan 的生成不仅与活细胞数成比例，也受作用时间的影响，因此当样品较多时测定的OD 值可能随时间而变。
3、MTT 溶液为黄色，需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。MTT 溶液在4℃或较低温度情况下会凝固，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
操作规程
1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.
2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。
3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。
4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。
5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。
6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。
7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。
8、结果分析
 a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（完全培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100
试剂盒使用注意说明：
1.由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2.最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。
3.不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书仅作参考。
4.只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到最佳的检测结果。
5.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。
6.使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。
7.若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。
8.某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。