ELISA显色强度多久可以读取

一、如何确定最佳读取时间？三种实用方法
方法1：‌经验时间法（基础但需标准化）‌
适用于常规实验、试剂盒说明书明确推荐的情况。
‌通常显色时间为5–30分钟‌，多数TMB底物在室温下15–20分钟可达理想强度。
✅ 关键操作：
从第一孔加入TMB开始计时；
严格统一每次实验的时间；
保持环境温度稳定（如37℃或室温平衡至22–25℃）。
适用于日常检测，但无法校正试剂批次差异或环境波动。
方法2：‌仪器动态监测法（推荐，精准控制）‌
若酶标仪支持动力学读数功能，可设置每30–60秒读取一次OD450，实时绘制显色曲线。
✅ ‌在线性期内选定读数时间点‌，确保所有样本处于同一反应阶段。
可避免因反应速率差异导致的数据偏差，显著提升重复性。
这是目前最科学的方式，尤其适合高价值样本或发表级研究。
方法3：‌参照孔判断法（日常推荐，客观可控）‌
在板上设置“哨兵孔”：如阳性对照或中高浓度标准品孔。
通过预实验确定其在线性期内对应的OD值（如OD620 = 0.6–0.85），当该孔达到目标值时立即整板终止。
✅ 优点：不受人眼主观判断干扰，实现跨批次一致性控制。
例如，监控S1孔在630 nm下OD达0.5–0.7，S5孔达0.05–0.08，空白孔<0.05时终止，可获得理想信号。
二、不同试剂盒类型的特殊考量

三、终止后读数时间也有讲究

‌终止反应后，应在5分钟内完成OD450读数‌。
原因：TMB与终止液（如硫酸）反应后，颜色会随时间逐渐变化，延迟读数可能导致数值漂移。