技术文献
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非特异性结果洗涤不充分可能导致多种非特异性结果,影响实验的准确性和可靠性。间接 ELISA 中洗涤不充分,核心是导致未结合的抗体、酶标物或样品杂质残留,进而引发两类非特异性结果:非特异性显色(假阳性 / 背景升高) 和信号干扰(结果重复性差),具体表现如下:
一、核心非特异性结果:非特异性显色
阴性对照假阳性
阴性对照(不含目标抗原的样品)本应仅产生极低信号,但若洗涤不充分,未结合的一抗(针对目标抗原的抗体)或酶标二抗(偶联 HRP/AP 的抗体)会残留于孔壁。这些残留抗体与后续加入的底物反应,导致阴性对照吸光度(A 值)显著升高(如超过 0.2,具体看试剂盒标准),误判为 “阳性”,即假阳性结果。
低浓度阳性样品信号偏高(假高值)
对于低浓度目标抗原的阳性样品,洗涤不充分带来的残留酶标二抗,会与特异性结合产生的酶标信号叠加。这种叠加会使检测到的 A 值远高于真实浓度对应的信号,导致计算出的抗原浓度偏高,出现假高值,干扰对样品中目标物质真实含量的判断。
空白对照背景异常升高
空白对照(仅加底物和终止液,无样品 / 抗体)的信号代表试剂本底,正常应极低(如 < 0.1)。若洗涤不充分,前一样品残留的酶标二抗、杂蛋白或样品杂质会污染空白孔,或洗涤液中混入酶标物,导致空白对照 A 值异常升高,掩盖真实信号差异,甚至使整个实验数据无效。
二、次要非特异性结果:信号干扰与结果不可靠
结果重复性差(CV 值超标)
洗涤不充分时,每孔残留的未结合物质含量不一致(如部分孔残留多、部分孔残留少)。即使检测相同浓度的标准品或样品,不同孔的 A 值也会出现显著波动,导致重复检测的变异系数(CV)超过 10%(常规要求),实验结果无法重复,失去统计意义。
标准曲线线性不佳
标准曲线依赖不同浓度标准品的 A 值呈线性关系(R²≥0.99)。若洗涤不充分,低浓度标准品孔因残留酶标二抗,信号被过度拉高;高浓度标准品孔的特异性信号与残留信号叠加后,可能出现 “平台期提前” 或信号偏离理论值,导致标准曲线线性断裂,无法准确计算样品浓度。
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