羊抗人纤维蛋白原-RBITC抗体材料和方法

羊抗人纤维蛋白原-RBITC抗体材料和方法

　　1.1 材料 人成骨肉瘤MG63细胞为本实验室保存。重组质粒MycSSH1L(WT)、MycSSH1L(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王岩教授惠赠。脂质体 2000。高糖DMEM培养基，胰蛋白酶和EDTA。A23187，KN93，CaM，重组Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain，Calbiochem)。抗体：Myc (9E10;Roche)，HA (3F10;Roche)，Pcofilin，Cofilin(Santa Cruz)， CaMKⅡδ1δ4 (Trans Genic Inc.)，PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒。

　　1.2 蛋白印迹实验 MG63细胞铺于35 mmol/L培养皿中，待细胞密度达到60%～70%时，转染MycSSH1L，48 h后换无血清培养基培养3 h，分别加入浓度为0.5，1，2.5，5 μmol/L的A23187孵育10 min后裂解细胞，离心取上清加入凝胶加样缓冲液,沸水浴上加热5 min，上样、电泳、转膜、杂交〔一抗分别为Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(14)〕、ECL显色。

　　1.3 体外激酶测定 MycSSH1L(WT)及其突变体MycSSH1L(2 SA)分别转染至MG63细胞，48 h后采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒的方法及抗cmyc抗体，对照组为抗IgG抗体。回收MycSSH1L，加入0.6 μg/ml重组活性CaMKⅡ(单独或同时加入抑制剂KN93)以及100 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 于 20 μl 激酶反应缓冲液中，30℃反应40 min。反应产物进行SDSPAGE电泳、转膜，应用放射自显影技术检测32P 标记的SSH1L水平。

　　1.4 体外SSH1L磷酸酶活性测定实验 MycSSH1L(WT)或MycSSH1L (2 SA)转染至MG63细胞，48 h后，采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒的方法及抗cmyc抗体，对照组为抗IgG抗体。回收MycSSH1L，加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(单独或同时加入抑制剂KN93)，20 μg/ml CaM，以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 于 20 μl 反应缓冲液(50 mol/L HEPES，pH 7.4，0.1 mol/L CaCl2，0.5 mol/L EDTA，3 mol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，1 mol/L dithiothreitol，0.5 mg/ml BSA，1 μg/ml leupeptin),中30℃反应2 h。反应产物进行SDSPAGE电泳、转膜、杂交(一抗分别为Pcofilin，Cofilin， cmyc 抗体)、ECL显色。