技术文献
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莱氏无胆甾原体PCR 检测试剂盒说明书
1、 试剂盒简介
流行性造血器官坏死病，是由无囊膜胞浆型虹彩病毒科蛙病毒属的流行性造血器官坏死病毒
（EHNV）所引起的鱼类疾病。病鱼因肝脏、脾脏、肾脏造血组织和其他组织坏死而导致死亡。易感动物主要为赤鲈、虹鳟等种类，其中，赤鲈对该病毒极为敏感，幼鱼和成鱼都可受 EHNV 感染。EHNV 属于虹彩病毒科蛙病毒属（除新加坡石斑鱼虹彩病毒之外）病毒，本公司针对蛙病毒属的流行性造血器官坏死病毒( epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)等病毒的主衣壳蛋白( MCP) 基因序列，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确 、安全、操作简单、应用广泛等特点及优点。
2、 试剂盒组成
试剂盒组成包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂，具体组成参见表 1：
表 1：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积
核酸提取试剂： 样品 DNA 提取液 1
样品 DNA 提取液 2 5ml×1 管
500µl×1 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
EHNV 荧光 PCR 反应液
Taq 酶(5U/ul) 阴性对照
EHNV 荧光阳性对照 5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存条件：样品 DNA 提取液 1、2 和试剂盒须在-20℃保存。
3、 样本采集，存放及运输
样本采集
采集活的或濒死的鱼的肾或脾等组织，研磨PBS稀释后提取核酸。或将细胞培养分离病毒的有CPE 的细胞悬液提取核酸病毒。
存放
研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融 3 次）。
运输
采用冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
4、 检测步骤
DNA 核酸提取操作方法(在样本处理区进行)：
取 n 个 1.5ml 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照和一管阴性对照之和， 对每个管进行编号标记。
每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照(阳性对照吸取前充分混匀)各 100µl，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s,于 4℃～25℃条件下， 12 000 r/min 离心 10 min。
尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混匀器上震荡混匀 5s,于 4℃～25℃ 条件下，2 000 r/min 离心 10 s。
100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清， 即为提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于-70℃冰箱内保存）。
荧光 PCR 检测
扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出荧光 PCR 反应液、Taq 酶，2000×g 离心 5 秒钟。每个样品测试反应体系配制见下表 2。
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 荧光 PCR 反应液 Taq 酶 合计
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
加样（样本处理区进行）：
向每个PCR 管中各分装15μL 的混合液，再分别加入样本DNA 模板10μL，盖紧管盖，500 r/min
离心 30 s。
荧光 PCR 检测（在检测区进行）： 循环条件设置：
一阶段，94 oC /4 min；
第二阶段，95oC/15 s，60 oC/60 s； 40个循环；在每次循环的60 oC退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
5、 结果判定
结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
质控标准
5.2.1阴性对照无Ct值或无扩增曲线。
5.2.2阳性对照的Ct值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
结果描述及判定
5.3.1阴性
无Ct值或无扩增曲线，示样品中无EHNV核酸。
5.3.2阳性
Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在EHNV核酸。为进一步确诊是EHNV，建议用普通PCR进行确认或测序。
5.4 有效原则
Ct>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
