TUNEL细胞凋亡试剂盒参考操作步骤及注意事项

TUNEL细胞凋亡试剂盒参考操作步骤：  
用二甲苯浸洗2次，每次5min；  
用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
PBS漂洗2次；  
用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；  
PBS漂洗2次；  
制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。  
玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。  
PBS漂洗3次；  
可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；  
玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
PBS漂洗3次；  
在组织处加50~100μl DAB底物，反应15~25℃×10min；  
PBS漂洗3次；  
拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。  
加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。  
 

注意事项  
进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。  
 PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。  
在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。  
TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。  
如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。  
用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 pH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。  
荧光素标记的dUTP液含甲次酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。  
试剂保存：未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 个月内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。  
9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。