大鼠MELK重组蛋白纯化的一般流程是什么

大鼠MELK重组蛋白纯化的一般流程
‌前期准备与蛋白表达‌
将大鼠MELK目的基因克隆至带His等亲和标签的表达载体，导入大肠杆菌/293等适配宿主细胞。
培养宿主细胞至对数生长期，加入诱导剂启动大鼠MELK重组蛋白的表达。
‌细胞收获与裂解‌
离心收集诱导完成的宿主细胞，弃上清后用裂解缓冲液重悬细胞沉淀。
通过超声破碎等方式充分裂解细胞，离心分离上清与沉淀，判断大鼠MELK重组蛋白是可溶性表达还是形成包涵体。
‌捕获阶段亲和纯化‌
选用Ni-NTA等适配标签的亲和层析柱，用平衡缓冲液充分平衡柱体。
将细胞裂解上清上样，让带标签的大鼠MELK重组蛋白特异性结合层析介质，用含低浓度咪唑的洗涤缓冲液洗去非特异性吸附的杂蛋白。
用高浓度咪唑的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，收集大鼠MELK重组蛋白的洗脱组分。
‌中度与精纯阶段‌
可通过离子交换层析进一步去除残留杂蛋白，再经凝胶过滤层析去除蛋白聚集体、置换缓冲液。
若实验需要去除标签，用TEV等特异性蛋白酶切割标签后，经二次亲和层析分离标签与目标蛋白。
‌质量验证‌
用SDS-PAGE电泳验证大鼠MELK重组蛋白的纯度与分子量，通过Western Blot确认目的蛋白身份。
采用BCA等方法测定蛋白浓度，分装后低温保存，完成整个纯化流程。