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抗凝山羊血(无菌 pet瓶装)制备方法

2021-8-18

抗凝山羊血(无菌 pet瓶装)制备方法:
此法用于制备间接法抗抗体。因抗原为可溶性,故多需加佐剂。
(1)淋巴结注射法
1)选择体重2~3Kg的健康雄性家兔( 2只以上),编号;
2)在家兔两后脚掌共注射活卡介苗,50mg(约0.6mL.每只足庶部皮下0.1mL,皮内0.2mL)。7~10d后,鼠或国窝处淋巴结肿大如黄豆或蚕豆大小;
3)用二指固定肿大之淋巴结,两侧淋巴结各注射加有完全佐剂的抗原o.5mL,共1mL。事先将抗原稀释为 5~10mg/ml,在免疫前一日加入青、链霉素,使青、链霉素的浓度分别为1000U/mL和1000mg/mL。4℃,次日取出与佐剂混合成乳剂。许多单位用两个注射器分别吸取佐剂与抗原,中间用细胶管连接,相互推进若干次,达到乳化目的;

4)10~14d后,于两侧淋巴结各注射加有完全佐剂的抗原0.25~0.5mL(这一次也可以省略);

5)7d后,于两侧淋巴结各注射加有不完全佐剂的抗原0.25~0.5mL;
6)试血:第三次免疫后7~10d,耳静脉取少量血,分离血清,用双扩散法,中间孔加抗原(1mg/mL),周围孔加不同稀释度的待检抗血清,37℃、 24h,观察结果,效价在1︰16以上,或者中间孔加抗血清,周围孔加不同稀释倍数的抗原。效价达4000倍以上即可应用;
7)放血:效价合格后即可放血。放血前停食12h。动物仰卧固定,颈部剪毛消毒,切开皮肤lOcm,找到颈动脉,将颈动脉和迷走神经剥离。选择血管中段,用两止血钳夹住(约 5cm),切开,放血(2500g重家兔可放血lOOmL);

8)分离血清:血液放于大试管、平皿或三角瓶中,凝固后,用铂耳或无菌滴管沿边缘剥离,先故37122h,再放4℃,使血清充分析出。离心沉淀,鉴定合格,冰箱保存备用。

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