人膀胱癌顺铂耐药株BIU-87/DDP注意事项

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一，烧瓶培养的处理程序

在培养瓶中接种细胞并在培养基中完全填充培养基以防止运输过程中细胞的丢失。

1、收到后，目视检查培养物是否有微生物污染的宏观证据。

使用倒置显微镜（配备有相位传感器），仔细检查是否有微生物污染的证据。还检查以确定大多数细胞是否仍然附着在烧瓶底部？在运输过程中，培养物有时被粗略地处理，并且许多细胞经常分离并悬浮在培养基中（但仍然是可行的）。

2、如果细胞仍然附着，无菌去除5至10毫升的运输介质。可以节省运输媒介以重复使用。在5%℃的空气中，在37℃下培养细胞，直到它们准备进行传代培养。

3.如果细胞没有附着，无菌地移除烧瓶的全部内容物，并以1000rpm离心5至10分钟。取出运输介质并保存。在10毫升这种培养基中重新沉淀颗粒细胞并加入25厘米的烧瓶中。在空气中5%℃下，在37℃下孵育，直至细胞准备进行传代培养。

二、传代程序

体积为75厘米的烧瓶。增加或减少其他尺寸培养容器所需的分离培养基的量。

1、去除和丢弃培养基。

2.用0.25%(w/v)胰蛋白酶0.53mM EDTA溶液冲洗细胞层，除去所有含有胰蛋白酶抑制剂的血清痕迹。

3.添加2.0~3.0 ml胰酶-EDTA溶液瓶中，倒置显微镜下观察细胞到细胞层分散（取决于胰蛋白酶的批）。

注意：为了避免结块，不要在击打或摇晃瓶子时搅拌细胞，等待细胞分离。难以分离的细胞可以放置在37°C以促进扩散。

4、加入6～8毫升的完整生长培养基，轻轻吸液，抽吸细胞。

5、在新培养容器中加入适当的细胞悬液等分试样。

6、培养37°C培养基。

推荐栽培比为1:3∶1:4。

介质更新：每周2至3次

三、冷冻保存程序

该协议使用量在75平方厘米的瓶；比例减少或增加的其他尺寸的分离介质的培养容器的数量。

1、去除和丢弃培养基。

2。简要冲洗细胞层0.25（w/v）trypsin0.53mm EDTA溶液去除所有痕迹血清含有胰蛋白酶抑制剂。

3。加入2至3毫升的胰蛋白酶-EDTA溶液瓶中，倒置显微镜下观察细胞到细胞层是分散的（通常在1到10分钟）。

注意：为了避免结块，不要在击打或摇晃瓶子时搅拌细胞，等待细胞分离。难以分离的细胞可以放置在37°C以促进扩散。

4、加入6～8毫升的完整生长培养基，轻轻吸液，抽吸细胞。

5。去除胰酶EDTA溶液，将细胞悬液到离心管和旋转约5 1000rpmfor 10分钟。

6、低温保存培养液中的上清液和复苏细胞。

7、将细胞转移至低温瓶，1ml／瓶。

8、低温容器中的细胞Frozen（NalgENα5100-01）。