小鼠骨髓染红细胞微核的测定方法具体有哪些

小鼠骨髓染红细胞微核的测定方法

实验原理

染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。大小应为主核的1/20～1/5。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。微核率是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，所以可用简易的、快速、灵敏的微核计数来代替繁杂的畸变染色体计数。Matter 和Schmid建立的微核测试是一种比较理想的方法，目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

实验对象

成年健康小鼠，体重25g左右，雌雄均可。

实验试剂与器材

（1）器材：显微镜、低速离心机、电子天平、解剖器械（搪瓷解剖盘、探针、剪刀、镊子）、注射器、试管、试管架、磨口试剂瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清洁载玻片。

（2）试剂：0.9％生理盐水、灭活的小牛血清、环磷酰胺、甲醇、PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。

实验方法与步骤

（1）环磷酰胺处理：取骨髓前24h先给小鼠腹腔注入环磷酰胺，注射剂量为100mg／kg动物体重。

（2）取骨髓：用损伤脊髓法处死小鼠，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿骨，用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后用注射器吸取5ml生理盐水，插入股骨一端，将骨髓细胞冲洗至10ml的离心管中。可重复冲洗多次，直至骨髓腔呈白色为止。

（3）离心处理：将所获得的细胞悬浮液以1000rpm离心10min，吸去上清液，在沉淀物中加入2滴灭活的小牛血清，制成细胞悬液。

（4）涂片：滴一滴悬液于载玻片一端，按常规方法涂片，在空气中晾干。

（5）固定：将晾干的载玻片放入甲醇固定液中10min，取出晾干。

（6）染色：将制片平放在玻璃板上，用1∶9∶10的Giemsa∶PBS∶瑞氏染液，染色15min，流水冲洗后晾干即可镜检。

（7）观察：嗜多染红细胞为年幼红细胞，呈灰蓝色，略大于红细胞（红色），微核多呈圆形和椭圆形，呈蓝紫色或紫红色（图13-3）。

（8）结果分析：在显微镜下，每只小鼠骨髓涂片标本计数1000~2000个嗜多染红细胞，包括其中出现微核的细胞数，将结果填入表内，并计算微核细胞率，观察记录结果（表13-2）。按100mg/kg体重剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺，其嗜多染红细胞微核率为（48.9±3.6）％。正常小鼠嗜多染红细胞微核率为5‰以下，超过5‰为异常。